产品名称：pEGFP-ADRB2（human）质粒

产品规格：05ug 质粒干粉

收到产品后，请根据产品管壁标签确认产品形式，并在扩增前仔细查阅该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。

质粒扩增流程

质粒干粉（常温运输，存于-20℃，保质期90天）。请务必进行转化并挑选单克隆培养，不要直接使用或测序。

1. 收到质粒干粉后，请先以5000rpm离心1分钟，然后加入20μl去离子水溶解质粒。
2. 取1支100μl感受态于冰上解冻10分钟，加入2μl质粒，再在冰浴中放置30分钟后，进行42℃热激60秒，再冰浴2分钟。（后续操作均需在超净工作台中无菌进行）
3. 加入900μl无抗LB液体培养基，180rpm震荡培养37℃ 45分钟。
4. 以6000rpm离心5分钟，仅保留100μl上清，重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上。（推荐使用尊龙凯时的平板涂布专用玻璃珠涂布，以提高转化效率）
5. 将平板正向培养1小时，随后倒置在37℃培养14小时。如果要求是30℃则培养20小时（若菌落过多，需要稀释质粒后再进行转化，若无菌落则加10μl质粒转化）。请注意，不要直接转化表达感受态，必须先转入克隆感受态，待重提质粒后再导入表达感受态。
6. 挑取单菌落至LB液体培养基中，添加对应抗生素，220rpm震荡培养14小时，依照实验需要和质粒提取试剂盒说明进行质粒提取。

其他产品形式

甘油菌种：（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，需划线挑单克隆培养）四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需先液体复苏后进行四区划线，再挑单菌落液体培养。

穿刺菌种：（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑取单菌落液体培养。

菌落平板：（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）直接挑取单菌落至液体培养基中。

液体质粒：（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）单独提取的液体质粒收到后可直接使用。

滤纸质粒：（常温运输，存于-20℃，保质期90天，须注意转化并挑单克隆培养，不得直接使用和测序）。收到后将滤纸上标记部分剪下，放入EP管中，加入100μl无菌水使滤纸湿润并浸泡5分钟，吸取5μl进行质粒转化，离心全涂。

提取步骤

实验原理：碱裂解法提取质粒，依据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的拓扑学差异分离二者。当pH在120~125范围时，线性DNA解开且变性，而共价闭合质粒DNA的两条链紧密结合。添加pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液后，质粒DNA保持结合，线性DNA则不再结合。离心后，染色体DNA及不稳定大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等被去除。

1. 准备20ml灭菌过的培养管，编号，分别加入8ml LB培养基，再加入8μl相应抗生素。
2. 用10μl白色枪头挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）。
3. 从过夜培养液中取2ml加入离心管，室温10000rpm离心2分钟，去上清。
4. 向含有菌体沉淀的离心管中添加250μl Buffer P1（含RNase A），充分混匀以悬浮菌体。
5. 加入250μl Buffer P2，温和上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液。
6. 向离心管中加入350μl Buffer N3，立即温和上下颠倒混匀4~6次，出现白色沉淀后，室温10000rpm离心15分钟。
7. 小心将上清液转移至洁净的吸附柱中，确保没有沉淀和细胞碎片，10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
8. 向吸附柱中加入150μl Buffer PB，10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
9. 加入400μl Buffer PW（需检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1分钟，再空离一次2分钟（可加热Buffer EB至65~70℃）。
10. 将吸附柱置于新离心管中，打开盖子，吹风约4分钟以去除乙醇。
11. 向吸附柱中加90μl Buffer EB（pET系列拷贝数低，加EB 70μl即可），室温静置2分钟。10000rpm离心1分钟。
12. 把液体倒回吸附柱，10000rpm离心1分钟。
13. 将质粒混合于一个离心管中进行标记，室温放置2小时保存于-40℃。

注意事项

1. 使用前，将RNA酶加入Buffer P1并于4℃保存。

2. Buffer EB在65~70℃水浴预热可提高提取效率。

了解更多质粒载体相关信息，请联系尊龙凯时，我们将竭诚为您服务。