大多数致病遗传变异是由碱基点突变、插入或缺失突变引起的，因此在活细胞内修复这些突变，以使细胞恢复正常，一直是生命科学的一个重要目标。近年来，出现了一种不依赖双链断裂和供体模板的新型基因编辑工具——引导编辑（Prime Editing，PE）。PE展示了纠正致病性突变和插入保护性等位基因的巨大潜力。尽管初代引导编辑的效率较低，但尊龙凯时的David Liu团队通过对pegRNAs进行了系统性优化，显著提升了其效果。

在David Liu团队的新研究中，通过优化双AAV载体系统成功实现了小鼠脑、肝、心等多种器官的高效Prime编辑，为基因治疗提供了新的技术手段。接下来，我们将探讨v3emPE如何发挥其功能。

v3emPE-AAV双载体系统介绍

v3emPE引导编辑系统由向导RNA（epegRNAs）引导，并通过融合逆转录酶MMLV与nCas9的方式辅助，实现目标位点碱基的精准编辑。该系统主要包括三个组分：epegRNAs、逆转录酶MMLV和nCas9。其中，MMLV与nCas9的编码序列长度（约63kb）远超AAV载体的包装极限（47kb）。为克服这一限制，将v3emPE与分裂型内含肽（intein）相结合，设计成双AAV载体系统：在nCas9的第1024位氨基酸处拆分PE编码序列，分别与来源于念珠藻的NpuDnaB快速剪接内含肽的N端和C端融合，构建在两个AAV载体上。共转染这两个AAV后，内含肽通过自剪切作用重新组成完整的PE蛋白，从而恢复编辑功能。

v3emPE-AAV双载体系统的改进点

1. **启动子升级**：采用强启动子Cbh替代传统的EFS启动子，显著提升PE蛋白表达水平。

2. **epegRNA稳定化**：通过在传统的pegRNA的3'端添加tevopreQ1修饰及8nt linker，显著优化了pegRNA的稳定性、编辑效率和特异性。这些优化使得编辑效率相比传统pegRNA提高了15至40倍。

3. **编辑策略**：使用高保真度的引导RNA（epegRNA）和单导向nicking sgRNA（sgRNA）来指导PE到目标DNA位点，设计距离编辑位点40至90nt的nicking sgRNA。

v3emPE-AAV双载体系统的应用

PCSK9 Q152H被视为“天然保护突变”，通过降低LDL-C水平显著减少冠状动脉疾病风险，同时无明显不良反应，因此可视为一种“有益突变”。相关文献利用v3emPE-AAV双载体系统成功实现了在成年小鼠的肝脏中31%和38%的精准编辑；与未处理的小鼠相比，编辑小鼠的总血浆胆固醇水平降低了20%，血浆低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平降幅达到27%。这验证了优化的v3emPE3-AAV系统能够在体内实现强大且与治疗相关的原位编辑，从而在相关组织中安装基因组突变。

v3emPE3-AAV系统的生物安全性

v3emPE3-AAV系统展现出了良好的生物安全性：- **脱靶效应**：通过CIRCLE-seq技术评估的10个潜在脱靶位点未检测到显著脱靶编辑，验证了Prime编辑的高特异性。- **毒性评估**：血清转氨酶（ALT、AST）水平及肝组织病理切片无显著异常，表明v3emPE-AAV系统没有明显的肝毒性。

作为新一代精准基因编辑方法，Prime Editor的创新性突出。尊龙凯时可以根据客户需求，通过设计个性化的epegRNA和nicking sgRNA，帮助实现目标基因的编辑。欢迎咨询我们获取更多信息！